Здоровье

Выделение и культивирование микроорганизмов

Способы культивирования микроорганизмов

Микробиология Введение в микробиологию0 A 0 B 10

Культивирование микроорганизмов можно поводить поверхностным или глубинным, периодическим или непрерывным методами, в аэробных или анаэробных условиях. Большое значение при выборе способа культивирования имеет отношение выбранного для культивирования микроорганизма к молекулярному кислороду и конечная цель культивирования: накопление биомассы или получение определенного метаболита (спирта, кислорода, фермента и т.д.).

При культивировании поверхностным способом микроорганизмы выращивают на поверхности плотной, сыпучей среды или в тонком слое жидкой среды, при этом микроорганизмы получают кислород непосредственно из воздуха. В жидких средах аэробные микроорганизмы часто растут, образуя на поверхности пленку. Факультативные анаэробы развиваются не только на поверхности, но и в толще жидкой среды, вызывая более или менее равномерное ее помутнение. На сыпучих средах поверхностным методом получают ферментные препараты. Поверхностное культивирование микроорганизмов применяется как в лабораторных условиях, так и в промышленности

Все способы культивирования аэробных микроорганизмов сводятся к увеличению поверхности соприкосновения питательной среды с кислородом воздуха. При глубинном культивировании в жидких средах микроорганизмы используют растворенный кислород. Вместе с тем растворимость кислорода в воде невелика, поэтому, чтобы обеспечить рост аэробных микроорганизмов в толще среды, ее необходимо постоянно аэрировать (подводить кислород в глубь жидкой среды). Сочетание питательной среды и растущих в ней микроорганизмов называют культуральной жидкостью .

Наиболее широко распространенный в лабораторной практике способ глубинного культивирования — выращивание на качалках, обеспечивающих встряхивание или вращение колб или пробирок, обеспечивая большее соприкосновение среды с воздухом и насыщение ее кислородом. Аэрировать культуру микроорганизмов можно продуванием (барботированием ) через толщу среды стерильного воздуха. Этот способ используется в лабораторных исследованиях, но особенно широкое применение он нашел в промышленной микробиологии при получении биомассы, в производстве антибиотиков, ферментов, кислот.

Преимущества глубинного культивирования заключаются в том, что этот способ не требует больших площадей и громоздкого оборудования, объем ферментаторов можно увеличить за счет увеличения высоты, простота обслуживания, возможность автоматизации, удобство выделения целевого продукта из культуральной жидкости.

Глубинное культивирование микроорганизмов может быть периодическим и непрерывным. При периодическом методе культивирования весь объем питательной среды засевают чистой культурой, и выращивание ведут в оптимальных условиях определенный период времени до накопления нужного количества целевого продукта. Поскольку культивирование ведется на невозобновляемой питательной среде (в стационарных условиях), клетки все время находятся в меняющихся условиях. Сначала они имеют в избытке все питательные вещества, затем постепенно наступает недостаток питания и отравление вредными продуктами обмена. В связи с этим культура в своем развитии проходит четыре фазы роста и размножения, в течение которых изменяются размеры клеток, скорость размножения, морфологические и физиологические свойства (рис. 3.1).

Первая стадия — лаг-фаза, или фаза задержки роста, следует непосредственно за внесением посевного материала в питательную среду. В этой фазе микроорганизмы не размножаются, а приспосабливаются к среде, происходит повышение содержания нуклеиновых кислот, увеличение размера. Эта стадия является подготовкой к дальнейшему интенсивному синтезу белка клеткой, т.е. ее росту и размножению.

Вторая стадия — фаза логарифмического роста(экспоненциальная) характеризуется высокой скоростью размножения клеток, так как в среде много питательных веществ и мало вредных продуктов обмена. Время, необходимое для удвоения числа клеток, называется продолжительностью генерации. В благоприятных условиях клетки бактерий делятся каждые 20-30 мин, их число увеличивается в геометрической прогрессии (1, 2, 4, 8, 16 и т.д.).

Третья стадия — стационарная (фаза зрелости), когда размножение микроорганизмов замедляется, и скорости размножения и отмирания уравновешиваются, в результате чего число клеток остается постоянным.

Четвертая стадия — фаза отмирания, когда начинается гибель клеток и их количество снижается за счет отмирания и автолиза (самопереваривания).

Рис. 3.1 Закономерность роста чистой культуры микроорганизма

Ооо "нпц химмедсинтез"

а — лаг-фаза; б — логарифмическая фаза; в — стационарная фаза; г- фаза отмирания.

Периодическое культивирование осуществляется во многих производствах, основанных на жизнедеятельности микроорганизмов. Недостатком периодического культивирования являются нерациональные затраты времени на прохождение всех четырех стадий развития культуры, причем период самой активной жизнедеятельности — фаза логарифмического роста — занимает небольшую часть производственного цикла.

В течение последних тридцати лет все большее значение приобретает более прогрессивный метод непрерывного культивирования микроорганизмов, который состоит в том, что культура находится в специальном аппарате, куда постоянно притекает свежая питательная среда и с такой же скоростью отводиться культуральная жидкость. Посевной материал выращивается до стадии логарифмического роста и вносится в питательную среду. Длительность периода логарифмического роста зависит от количества питательных веществ в среде, а также от количества вредных продуктов обмена, выделяемых клеткой.

При большой скорости притока среда быстро обновляется, питательные вещества не успевают накопиться и культура поддерживается сколь угодно долго в активном состоянии, не достигая стадии отмирания. Несмотря на значительное аппаратное усложнение технологического процесса, метод непрерывного культивирования имеет ряд преимуществ по сравнению с периодическим способом.

В последние годы активно разрабатывается и применяется метод непрерывного культивирования клеток микроорганизмов в иммобилизованном (прикрепленном) состоянии — на пленках, гранулах, волокнах специально подобранных синтетических полимерных материалов. Иммобилизованные клетки микроорганизмов функционируют многократно и в течение длительного времени сохраняют высокую биохимическую активность.

Непрерывное культивирование очень перспективно и широко используется в пищевой и микробиологической промышленности и создает возможность автоматического поддержания заданных оптимальных условий, благодаря чему обеспечивается стандартность готового продукта при наименьших затратах.

studopedia.org — Студопедия.Орг — 2014-2018 год. (0.006 с).

Источник: http://studopedia.org/3-132512.html

2. Культивирование микроорганизмов

Программа курса «Основы биотехнологии

Цель курса.

Основной целью курса является формирование у студентов- химиков общих представлений о современной биотехнологии,которую называют технологией ХХIвека, благодаря её огромным и практически неограниченным возможностям производить не только уникальные химические продукты, но и усовершенствовать уже освоенные химической технологией процессы. Незаменима роль биотехнологии в решении экологических проблем, связаных с различными областями хозяйственной деятельности человека.

Содержание курса

Стафилококк золотистый: симптомы, лечение, клиническая картина

Введение

Биотехнология и её место среди современных технологических производств. История развития и становления современного микробиотехнологического синтеза. Бурное развитие биотехнологии в XX веке в связи с достижениями биохимии, генетики, и молекулярной биологии. Перспективы развития биотехнологии и области применения биотехнологических продуктов.

Международное сотрудничество в области развития биотехнологии и подготовки квалифицированных кадров. Спрос на мировом рынке на продукцию биотехнологии.

Тема I. Микроорганизмы — объекты биотехнологических производств.

Классификация микроорганизмов. Прокариоты, эукариоты, археобактерии. Особенности клеточного метаболизма. Биологическое единство всего живого на земле. Трофические цепи и круговорот элементов в природе. Возможности использования микроорганизмов и их метаболитов для удовлетворения различных потребностей человека. Промышленные штаммы микроорганизмов. Источники получения, критерии отбора. Селекция продуктивных штаммов. Рекомбинантные методы улучшения производственных характеристик микроорганизмов. Клеточная инженерия. Генетическая инженерия. Создание генно-инженерных мутантов, как биотехнологических продуцентов.

Тема 2. Культивирование микроорганизмов.

Особенности микробного роста. Периодические и непрерывные культуры. Питательные среды. Поверхностное и глубинное культивирование. Аэробы и анаэробы. Управляемое культивирование.

Тема 3. Основные этапы биотехнологических производств

Компоненты биотехнологического процесса. штамм-продуцент (засевной материал). Сырьё для получения питательной среды, оборудование для культивирования микроорганизмов и выделения готового продукта.

Хранение чистых культур штаммов продуцентов. Выращивание засевного материала (инокулята) в цехе чистой культуры. Инокулирование (засев) главного реактора (ферментера). Подготовка питательных сред природных и искусственных. Использование отходов пищевой и химической промышленности в качестве питательных сред. Стерилизация. Ферментация — основная стадия биотехнологического процесса. Биореакторы (ферментеры) периодического и непрерывного действия. Конструкции ферментеров, обеспечивающие оптимальные условия протекания ферментации. Системы отвода тепла,

аэрации, пеногашения. Особенности перемешивания культуральной жидкости. Типы мешалок для ферментеров. Выделение продуктов биотехнологических производств: биомассы и метаболитов. Фильтрация, упаривание, высушивание. Получение товарных форм. Микробиологические и технологические факторы, влияющие на производительность и экономичность биотехнологических процессов. Способы оценки производительности периодических и непрерывных производств.

Тема 4. Производство микробной биомассы

Белок одноклеточных — белково-витаминный концентрат (БВК) — пищевая добавка для корма скота. Субстраты для производства БВК, их доступность, сравнительная экономическая оценка вклада стоимости субстрата в цену биомассы.

Pathology and Bacteriology - IZW Leibniz Institute for Zoo and Wildlife Research in the Forschungsverbund Berlin e. V.

Белок одноклеточных — пищевые добавки для человека. Дрожжи рода сахаромицет -пищевая добавка для человека. Спирулина и пивные дрожжи — источники витаминов. Использование в медицине. Грибной белок.

Энзиматически активная биомасса. Пекарские дрожжи для хлебопечения. Особенности культивирования. Товарные формы. Бактериальные удобрения. Бактерии диазотрофы. Особенности процесса азотфиксации нитрогеназа. Получение бактериальных удобрений на основе клубеньковых бактерий-симбионтов растений. Азотобактеры особенности культивирования. Усовершенствование штаммов — азотфиксаторов.

Биоинсектициды. Бактериальные, грибные и вирусные инсектициды. Условия сохранения инсектицидной активности.

Тема 5. Технология бродильных производств.

Спиртовое брожение. Химизм процесса. Производство пива, вина, этанола, глицерина. Молочнокислое брожение. Производство молочной кислоты и кисломолочных продуктов. Маслянокислое и ацетоно-бутиловое брожение. Химизм процесса. Применение продуктов брожения.

Тема 6. Микробное окисление органических веществ в аэробных условиях.

Производство пищевого уксуса, пропионовой кислоты, ацетона, ацетона, D-фруктозы, D-глюкозы, и других продуктов.

Тема7. Ферменты в биотехнологии

Микроорганизмы как источники ферментов. Внеклеточные и внутриклеточные ферменты. Выделение и придание хранящейся формы ферментным препаратам. Папаин, пепсин, трипсин амилазы, липазы, протеазы, глюкозооксидазы, инвертазы. Типы ферментных препаратов, используемых в биотехнологии. Иммобилизованные клетки и ферменты. Способы их закрепления на носителях. Современные технологии, основанные на применении иммобилизованных ферментов.

Технология получения глюкозо-фруктозного сиропа. Производство безлактозного молока, искусственного подсластителя аспартама. Ферменты, как лекарственные препараты. Ферменты — катализаторы процессов органического синтеза.

Тема 8. Производство аминокислот

Аминокислоты и их использование в пищевой промышленности и медицине. Незаменимые аминокислоты. Химический и микробиологический синтез аминокислот. Получение L-глутаминовой кислоты с использованием диких штаммов коринебактерий. Использование ауксотрофных мутантов для биосинтеза L-лизина.

Питательная среда творчества

Тема 9.Производство антибиотиков

Антибиотики — низкомолекулярные продукты вторичного микробного метаболизма. Физиологическое действие антибиотиков. Выделение, селекция и мутация штаммов микроорганизмов-продуцентов антибиотиков и их культивирование. Пенициллины. Микробиологическое производство пенициллина. Фермент пенициллаза. Синтез аналогов пенициллина. Ферментативный способ получения 6-аминопенициллановой кислоты и её ацилированние.

Стадии производства антибиотиков. Условия проведения ферментации, особенности выделения готового продукта.

Тема10. Производство гормонов

Инсулин-гормон поджелудочной железы. Биосинтез и физиологическое действие. Установление строения и синтез инсулина. Выделение инсулина из поджелудочной железы домашних животных. Свиной инсулин. Микроорганизмы с рекомбинантной ДНК, содержащей ген человеческого инсулина. Экономическая характеристика различных способов производства инсулина.

Интерферон-гормон иммунной системы, образование в организме и его физиологическое действие. Производство лейкоцитарного интерферона из донорской крови. Ген интерферона и синтез копии ДНК интерферона на мРНК. Микроорганизмы с рекомбинантной ДНК с геном интерферона. Биотехнология производства интерферона, особенности его выделения и очистки.

Соматотропин (гормон роста). Выделение соматотропина из трупного материала. Биотехнологический способ производства соматотропина.

Тема11. Биотехнология в энергетике

Микробиологическое обессеривание каменных углей. Применение метанотрофных микроорганизмов для ассимиляции рудничного газа.

Применение микроорганизмов в нефтедобывающей промышленности для полноты извлечения нефти из нефтяных скважин.

Производство этанола из биомассы и использование его в качестве жидкого топлива.

Метановое брожение. Химизм брожения. Производство биогаза. Сырьё, конструкции

метантанков и технология проведения процессов.

Проблема микробиологического фотолиза воды с целью получения водорода.

Фотохромные материалы и красители. Бактериородопсин. Применение бактериородопсина

ПРИНЦИПЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР МИКРООРГАНИЗМОВ - Культивирование аэробных и анаэробных микроорганизмов - YouTube В тоге и сан

для создания фотохромных материалов. Выделение гена, кодирующего синтез индиго.

Создание бактерии — продуцента индиго.

Тема1I. Биометаллургия

Хемотрофные бактерии. Микробиологическое выделение из бедных руд, а также из отходов (отвалов) металлургических производств: меди, урана, свинца, цинка, серебра, золота, марганца.

Тема13. Экология и биотехнология

Условия производственной и экологической безопасности биотехнологических производств.

Микробиологическая очистка сточных вод и экономически рентабельное использование многотоннажных отходов производственной и бытовой деятельности человеческого общества.

Литература (основная)

1.Т.А.Егорова, С.М.Клунова,,Е.А.Живухина Основы биотехнологии:Учеб. пособие для педвузов/- М. Изд. центр «Академия», 2003 .

2. Биотехнология (под редакцией А.А.Баева) М. «Наука», 1984.

3. Л.И. Воробьёва. Техническая микробиология. Изд. МГУ, 1987.

4. Альберт Сассон. Биотехнология: свершения и надежды. М. «Мир», 1987

5 Н.С.Простаков, Т.Н. Борисова Основы биотехнологии:Учебное пособие – М.,Изд РУДН,1992.

Среды для культивирования бактерий - презентация, доклад, проект

Дополнительная

1. Г. Шлегель. Общая микробиология. М. «Мир», 1987

2.Биотехнология. Принципы и применение. М. «Мир», 1988.

Источник: http://rudocs.exdat.com/docs/index-63542.html

МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ В ПРОЦЕССЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Завершающей стадией любого микробиологического производства является выделение целевого продукта из культуральной среды и его очистка. Таким целевым продуктом может быть либо биомасса клеток, либо какой-то продукт клеточного метаболизма. Если целевой продукт-метаболит находится внутри клетки (накапливается или входит в состав клеточных структур и оболочки), то он является эндометаболитом. если выделяется клеткой в культуральную жидкость — экзометаболитом.

В большинстве случаев извлечения эндометаболитов необходимо предварительное разрушение клеток. Однако этот процесс удобнее проводить не непосредственно в культуральной среде, извлекаемой из реактора-ферментера, а с концентратом клеток после удаления культуральной жидкости. Поэтому первым этапом выделения большинства продуктов микробиологического синтеза является отделение биомассы микроорганизмов продуцентов от культуральной жидкости. При этом в зависимости от типа используемых микроорганизмов могут применяться самые различные методы.

Для отделения самых мелких по размеру бактериальных клеток использование обычных фильтров, работающих под действием силы тяжести фильтруемой жидкости, невозможно. Для этого используются специальные устройства — вакуум-фильтры и нутч-фильтры, в которых процесс фильтрования ускоряется за счет принудительного увеличения разности давлений над и под фильтрующей перегородкой. В нутч-фильтре (рис.1) избыточное давление создается над слоем фильтруемой жидкости. У вакуум-фильтров (рис.2 — барабанный, рис.3 — ленточный) перепад давлений возникает за счет создания пониженного давления под фильтрующей поверхностью. Фильтрование бактериальных суспензий — процесс очень медленный и сопряжен с большими трудностями, которые обусловлены малым размером клеток и, как следствие, еще меньшим размером пор фильтра, высокой вязкостью суспензий и наличием большого количества примесей микрочастиц различной природы. Поэтому стадии фильтрования обычно предшествует предварительная обработка суспензий с целью максимально возможной коагуляции клеток и примесей в более крупные и легко фильтруемые частицы. Применяются несколько видов коагуляции. тепловая, органическими и неорганическими кислотами, неорганическими солевыми электролитами (Na2 SiO3. Na2 HPO4 ), которые взаимодействуют с ионами Са 2+. находящимися в культуральной жидкости, с образованием труднорастворимых соединений. Образующиеся частицы осадка захватывают клетки микроорганизмов и примеси.

Процесс коагуляции улучшается при использовании комбинированных методов, таких, как кислотная и тепловая, электролитная и тепловая коагуляция. Эффективным методом коагуляции суспензий является обработка их высокомолекулярными полиэлектролитами — флокулянтами. При этом в отличие от обычной коагуляции образуются флоккулы, или осадки рыхлой структуры, что значительно улучшает процесс фильтрации.

Образующиеся в результате коагуляции и флокуляции крупные частицы перед фильтрованием могут быть подвергнуты процессу седиментации (осаждению под действием силы тяжести) с последующей декантацией -сливом надосадочной жидкости, которая далее может быть дополнительно очищена фильтрованием.

Осадки большинства микробных клеток относятся к разряду сжимаемых, то есть уплотняющихся, поэтому со временем скорость фильтрации будет заметно уменьшаться. Для облегчения фильтрации микробных суспензий и уменьшения перепадов в скоростях фильтрации используют барабанный или ленточный фильтр с намывным слоем — аппарат полунепрерывного действия. Перед работой на фильтрующую поверхность наносят специальный дренажный слой, представляющий собой порошок диатомита, фильтрперлита (размолотые вулканические породы, содержащие SiO2 и Al2 O3 ) или древесной муки. В процессе фильтрования клетки оседают на этот слой. Особенность работы такого фильтра (в отличие от обычного вакуум-барабанного или ленточного) состоит в том, что нож, предназначенный для съема осадка с барабана, имеет специальную регулируемую микрометрическую подачу. С каждым оборотом барабана нож подается к центру, срезая нафильтрованный осадок вместе с тонким слоем дренажа, обновляя, таким образом, фильтрующую поверхность поэтому скорость фильтрации не снижается.

Для предварительного концентрирования (сгущения) более крупных и тяжелых клеток дрожжей и микрогрибов широко используют флотацию. Основной движущей силой флотации являются всплывающие пузырьки газа, которые захватывают клетки и выносят их на поверхность. В результате над слоем отработанной культуральной жидкости образуется пенный слой, в котором сконцентрированы клетки. Процесс проводят в специальных аппаратах — флотаторах, в которых нагнетают воздух и, в зависимости от их конструкции, диспергируют его через барботер или эжектор, пену гасят и выводят сконцентрированную в 4-6 раз суспензию клеток (получение пекарских дрожжей).

Для последующего концентрирования и отделения биомассы грибов и дрожжей используют сепарирование (одноступенчатое или многоступенчатое)

для разделения суспензий и эмульсий, а так же центрифугирование для отделения твердых осадков и клеток от культуральной жидкости (рис. 4, 5). Так для сгущения суспензии дрожжей от 20-30 г/л до 550-600г/л с помощью сепаратора-сгустителя непрерывного действия тарельчатого типа СОС-501 К-3, необходимо последовательное сепарирование в 2-3 ступени. С помощью центрифуг различных конструкций удается отделять из культуральных жидкостей бактерии, дрожжи, грибы. Наличие в культуральной жидкости высоковязких компонентов, таких как различные экзополисахариды типа декстрана, аубазидана, пуллулана и др. существенно затрудняет процесс центрифугирования.

Для извлечения целевых продуктов эндометаболитов из концентрата микробной биомассы ее либо обрабатывают каким-либо экстрагентом без разрушения клеток (экстракция петролейным эфиром биожира из кормовой биомассы дрожжей, извлечение полиеновых антибиотиков), либо клетки разрушают каким-либо из методов, а затем экстрагируют продукты.

Для разрушения (дезинтеграции) клеток применяют целый набор методов, которые можно отнести к трем основным группам:физико механические, химические и энзиматические (ферментные) методы. Все процедуры должны быть достаточно жесткими, чтобы разрушить клеточную стенку, и в то же время достаточно мягкими, чтобы исключить денатурацию или разрушение целевого продукта. А поскольку клеточные стенки у разных микроорганизмов состоят из различных полимеров (иногда сопоставимых или превосходящих по прочности лучшие сорта сталей), то никакого универсального метода их разрушения не существует. Еще одним фактором, обеспечивающим прочность клеточной стенки, является клеточный тургор — напряжённое состояние клеточной оболочки, создаваемое гидростатическим давлением внутриклеточной жидкости. В клетках внутреннее давление на клеточную стенку всегда значительно превышает давление на неё наружного раствора. У большинства растений тургорное давление лежит в пределах 5-10 атм, у галофитов, грибов — 50-100 атм. Таким образом любая клетка похожа на упругий резиновый мяч, и это значительно повышает ее устойчивость к механическим нагрузкам.

К физическим методам относятся: механическое разрушение клеток путем их растирания с применением кварцевого песка или в дисковой мельнице, дробление замороженных в жидком азоте или в сухом льде клеток; экструдирование (продавливание) клеток под высоким давлением (2-5 атм.) через узкую щель или отверстие; газодекомпрессион­ная дезинтеграция, основанная на создании в камере с разрушаемым материалом высокого давления и быстрым сбросом его, приводящим к разрыву клеточных стенок; ультразвуковая дезинтеграция.

Энзиматические методы основаны на применении литических ферментов, разрушающих клеточную стенку: лизоцима. выделяемого из белка куриных яиц и разрушающего главным образом оболочки бакте­ри­альных клеток; ферментного комплекса, содержащегося в желудочном соке улитки Helix pomatia или продуцируемого некоторыми видами актиномицетов, лизирующего оболочки эукариотических клеток, в частности грибов. Для разрушения клеточных стенок растений используют комплекс целюлолитических ферментов.

Химические методы дезинтеграции основаны на гидролизе клеточной оболочки под воздействием водных растворов щелочей, кислот, а так же под воздействием различных детергентов (моющие средства разрушающие липидные слои клеточной стенки), ингибиторов синтеза оболочки клетки (некоторые антибиотики).

Выбор метода дезинтеграции определяется целью работы: для получения внутриклеточных ферментов наиболее приемлемы физико-механические способы; энзиматические методы широко применяют в научных исследованиях для выделения в целости различных субклеточных структур (органелл, мембран и т.д.), а так же для получения протопластов. Применение химических методов дезинтеграции микроорганизмов ведет к разрушению целостности клеточных структур, инактивации ферментов и гидролизу многих продуктов. Поэтому химические методы обычно применяют для получения пищевого белка и биожира из дрожжей.

В результате обработки клеточной биомассы по одному из методов дезинтеграции получают гомогенат, содержащий неразрушенные клетки, оболочки разрушенных клеток, обрывки мембран, различные клеточные структуры, которые могут быть отделены путем фильтрования. При этом большая часть веществ-эндометаболитов переходит в культуральную жидкость или раствор экстрагента.

Дальнейшее выделение и очистка целевых продуктов из культуральной жидкости или экстрактов зависит от их химической и физической природы.

Для извлечения таких соединений, как спирты, карбонильные соединения, кислоты, их производные, большинство антибиотиков, витаминов, алкалоидов, применяют обычные приемы и методы, используемые в химической технологии (перегонку, выпаривание, экстракцию, перекристаллизацию, возгонку и др.). В качестве примера приведем технологию экстракционного выделения бензил­пенициллина из культуральной жидкости.

Современное производство бензилпенициллина включает в себя стадию глубинного культивирования микроорганизма-продуцента с последующим извлечением целевого продукта из культуральной жидкости.

На первом этапе мицелий отфильтровывается от культуральной жидкости (обычно на барабанных вакуум-фильтрах непрерывного действия). Фильтрат культуральной жидкости (нативный раствор) затем подвергается предварительной обработке (дополнительная фильтрация с применением активированного угля).

Выделение пенициллина из нативного раствора основано на способности пенициллина в виде кислоты растворяться в бутилацетате, в воде он нерастворим. Калиевая соль пенициллина, напротив, хорошо растворима в воде и нерастворима в бутилацетате. В производстве после передачи нативного раствора цеху химической очистки в сборник нативного раствора перед началом экстракции добавляют 0.03-0.06 масс.% дезэмульгатора (авироль) для лучшего разделения эмульсии.

Нативный раствор из сборника подают в эмульгатор, куда одновременно подается 9-12% раствор H2 SO4 и охлажденный бутилацетат. В эмульгаторе происходит смешивание всех трех компонентов и экстрагирование бензил­пенициллина (кислоты) бутилацетатом. Температуру процесса поддерживают в пределах 10-120 С, рН среды – 2,8 ± 3,0. При таком значении рН резко уменьшается степень диссоциации карбоксильных групп молекул бензил-пенициллина, в недиссоциированном состоянии они переходят в органическую фазу (бутилацетат). Более сильные кислоты и другие электролиты находятся в диссоциированном состоянии и поэтому не растворяются в бутилацетате; в водной фазе остаются почти все минеральные компоненты, аминокислоты, водорастворимые белки. Затем эмульсия поступает в экстрактор, где дополнительно обрабатывается бутилацетатом.

Далее бутилацетатный экстракт последовательно отмывают обессоленной водой и подвергают двухступенчатой экстракции водным раствором бикарбоната натрия NaHCO3 при рН = 7,3 -7,8. При этих условиях пенициллин находится в диссоциированном состоянии и хорошо растворяется в водной фазе и практически не растворим в бутилацетате. На данной стадии удается, очистится от примесей (в основном органических), являющихся более слабыми кислотами, чем бензилпенициллин.

Из бикарбонатного экстракта антибиотик вторично экстрагируют бутилацетатом при рН = 2,2 – 2,5.

Полученный вторичный бутилацетатный экстракт осветляют обработкой с активированным углем, далее вымораживают при -5°С в течение 20-30 минут, отфильтровывают от кусочков льда и кристалликов сульфата натрия, обезвоживая, таким образом, бутилацетатный экстракт.

Выделение калиевой соли бензилпенициллина из бутилацетатного экстракта проводят путем добавления к нему рассчитанного количества насыщенного раствора ацетата калия (раствор ацетата калия готовят в отдельном аппарате).

Полученную калиевую соль дополнительно очищают перекристаллизацией из водно-бутанольного раствора, полученные кристаллы отфильтровывают, промывают безводным бутанолом и сушат.

Наибольшую сложность представляет выделение продуктов белковой природы. ферментных препаратов, белковых антител, вакцин, гормонов и других физиологически активных веществ. Поэтому рассмотрим подробнее особенности их выделения и очистки на примере получения ферментных препаратов.

studopedia.org — Студопедия.Орг — 2014-2018 год. (0.07 с).

Источник: http://studopedia.org/10-126810.html

Культивирование микроорганизмов

Содержание

↑ Требования микроорганизмов к питательным веществам

Культивирование микроорганизмов – это один из основных приемов в микробиологии. Для роста и развития микроорганизмов в природе и в лабораторных условиях необходимо наличие питательных веществ для энергетических и конструктивных реакций. Требования разных групп микроорганизмов к источникам энергии и химическим элементам определяются их метаболическими возможностями. Выращивание и поддержание микробных культур в лаборатории основано на моделировании естественных условий обитания данного организма в лаборатории, а также на знании особенностей обмена веществ.

Основными биогенными элементами являются углерод, азот, фосфор, кислород, водород, сера. Это компоненты белков, углеводов и жиров, а также нуклеиновых кислот. Эти элементы требуются в значительных количествах (г/л) и поэтому их называют макроэлементами. К макроэлементам также относятся ионы калия, магния, натрия, кальция и железа. Они выполняют в клетке разнообразные функции. Например, К + необходим для активности большого числа ферментов и в частности ферментов белкового синтеза. Са 2+ определяет устойчивость бактериальных эндоспор к нагреванию. Mg 2+ стабилизирует рибосомы, многие ферменты и клеточные мембраны. Fe 2+ и Fe 3+ являются частью цитохромов и кофакторами электронпереносящих белков.

Микроэлементы, необходимые в микромолярных количествах, — это ионы таких металлов, как хром, кобальт, медь, молибден, марганец, никель, селен, вольфрам, ванадий, цинк, обычно входящие в состав ферментов и кофакторов. Например, Со 2+ является компонентом витамина В12. Cu 2+ входит в состав цитохромоксидазы и купредоксинов, Mn 2+ активирует ферменты, катализирующие перенос фосфатных групп, Мо 2+ входит в состав нитрогеназы и нитратредуктазы, Ni 2+ является компонентом уреазы, гидрогеназы, кофактора F430. Zn 2+ входит в состав карбоангидразы, ДНК- и РНК-полимераз и т.д. Необходимые для микроорганизмов количества микроэлементов содержатся в обычной водопроводной воде. При работе на дистиллированной воде микроэлементы добавляют специально в виде растворов их минеральных солей. Некоторые группы микроорганизмов проявляют специфические потребности. Так, диатомовые водоросли, включающие в свои клеточные стенки значительные количества соединений кремния, требуют добавления их в среду в высокой концентрации.

Биогенные элементы должны присутствовать в питательной среде в доступной для микроорганизмов форме. Как правило, ионы металлов, сера, фосфор и микроэлементы добавляют в среду в виде минеральных солей. Минеральная основа среды (минеральный фон) практически одинакова для большинства микроорганизмов.

Источники углерода и азота в среде могут быть как неорганическими соединениями (СО2. N2. карбонаты, нитриты, нитраты, аммонийные соли), так и органическими веществами разной степени сложности и окисленности (сахара, спирты, органические кислоты и аминокислоты, олигосахариды, пептиды и т.д.). Если микроорганизму требуется набор источников углерода или азота, и тогда применяют различные экстракты и гидролизаты смеси белков и полисахаридов неопределенного состава (сусло, гидролизат молочного белка, пептон и др.).

У некоторых микроорганизмов спектр потребляемых органических веществ очень широк (например, у Pseudomonas. Actinomyces ), у других – достаточно узок (например, у облигатных метилотрофов). В то же время, можно найти микроорганизмы, способные использовать сложные неприродные соединения типа пластиков, красителей, пестицидов. У некоторых микроорганизмов потребности в питании так сложны, что они растут только внутри живого организма (например, внутриклеточные паразиты риккетсии и хламидии).

Как правило, лабораторные среды содержат питательные вещества в более высоких концентрациях, чем это присуще природным местообитаниям. Для разных микроорганизмов границы значений физико-химических факторов, в которых может происходить рост, существенно отличаются. Поэтому важным условием успешного культивирования является поддержание оптимальных значений таких параметров, как рН, температура, освещенность, аэрация и т.д.

↑ Типы сред и способы культивирования микроорганизмов

Разнообразные питательные среды, используемые в микробиологической практике для культивирования микроорганизмов, подразделяются по составу, физическому состоянию и назначению.

По составу среды делятся на натуральные и синтетические. Синтетические среды применяют для изучения обмена веществ у микроорганизмов. Они имеют определенный химический состав с точным указанием концентрации каждого соединения. Натуральные среды применяют для накопления биомассы микроорганизмов и широко используют для первичного выделения из естественных субстратов, поскольку их состав позволяет удовлетворить питательные потребности многих групп микроорганизмов. В них содержатся богатые различными органическими веществами продукты животного или растительного происхождения, имеющие сложный и непостоянный состав. Часто натуральные среды готовят на основе мясо-пептонного бульона (МПБ) и солодового сусла. МПБ – это прокипяченный экстракт мясного фарша с добавлением пептона и поваренной соли. Он богат азотсодержащими органическими соединениями, но обеднен углеводами. Солодовое сусло, напротив, содержит преимущественно углеводы. Его получают путем настаивания размолотого солода в водопроводной воде при постепенном нагревании. Солодом называют пророщенные и высушенные зерна ячменя. В процессе приготовления сусла происходит гидролиз крахмала ячменя и экстракция сахаров в воду. В зависимости от партии зерна концентрация сахаров в сусле может быть разной. Ее выражают в градусах Баллинга ( о Б), что примерно соответствуют процентному содержанию сахаров в растворе. Сусло с разной концентрацией сахаров применяют для выращивания разных групп микроорганизмов.

Жидкие среды представляют собой растворы или суспензии ингредиентов в воде. В качестве сыпучих сред применяют наборы длительно хранящихся сухих компонентов, которые перед работой растворяют или смачивают водой. Это могут быть зерно, отруби, твердые отходы сельского хозяйства и пищевой промышленности. В настоящее время получили широкое распространение порошкообразные синтетические и натуральные среды. Для получения твердых сред в жидкую основу добавляют уплотняющие агенты. Наиболее известными отвердителями являются желатин, агар и силикагель. Желатин – это белок из соединительной ткани животных, образующий гель при 25 о С. Неудобство его применения заключается в том, что температура роста многих микроорганизмов выше, чем температура плавления желатина. Наличие протеолитических ферментов у многих микроорганизмов приводит к расщеплению и разжижению желатина. Более удобен как уплотнитель сложный полисахарид агар, получаемый из морских бурых водорослей, так как большинство микроорганизмов не использует его для питания. Агар может многократно плавиться при 100 о С и застывать при 45 о С. Добавлением 2% агара в жидкую основу получают широко применяемые мясо-пептонный агар (МПА), сусло-агар (СА) и бульон-сусло-агар (БСА). В качестве твердой основы для синтетических сред часто используют неорганическое соединение кремния силикагель.

По назначению среды подразделяются на универсальные, элективные и индикаторные. Универсальные среды используют для накопления микробных клеток и первоначального выявления видового разнообразия микроорганизмов в смешанных популяциях. Они позволяют поддерживать рост значительного числа микроорганизмов. В то же время следует помнить, что не существует одной среды, универсальной для всех микробных культур. Элективные среды используют для получения накопительных культур как первого этапа при выделении чистой культуры из природных местообитаний. Создание условий, благоприятных для определенной группы микроорганизмов (элективных условий), приводит к преобладанию в смешанной популяции желаемых микроорганизмов. Рост и размножение других микроорганизмов в этих условиях не значительны. Для быстрого выявления определенных групп микроорганизмов или особенностей их метаболизма применяют индикаторные среды, содержащие вещество-индикатор, реагирующий изменением цвета на проявление какого-либо свойства организма. Индикаторные среды наиболее часто используют в санитарной и медицинской микробиологии.

↑ Способы культивирования микроорганизмов

Особенности роста микроорганизма (культуральные свойства) иногда служат одним из критериев при определении его систематического положения. Микробные клетки в зависимости от условий могут расти в виде суспензии, микроколоний или обрастаний в жидких средах и образовывать колонии, штрихи или газон на твердых средах. Глубинные колонии формируются в толще агаризованных сред в виде чечевичек, тонких пленок или пучков ваты. Из-за выделения газов микроорганизмами при глубинном росте могут наблюдаться разрывы агаризованной среды. Поверхностные колонии отличаются большим разнообразием формы, размера, цвета, профиля. Колония может быть прозрачной, плотной, мягкой, хрупкой, врастать в агар, сниматься целиком в виде пленки, тянуться за петлей и т.д. Ее поверхность может быть блестящей или матовой, гладкой или шероховатой, иметь различные выпуклости, исчерченность и т.д. Различия в форме края и структуре колоний можно увидеть при малом увеличении микроскопа. Морфология колоний может значительно изменяться в зависимости от состава среды, возраста культуры и температуры культивирования. При посеве штрихом (прямой линией по агару) рост бывает обильный или скудный, сплошной или в виде цепочек очень мелких колоний, перистый, древовидный с различной формой края. При развитии культуры в жидких средах развитие микроорганизма может приводить к окрашиванию среды и появлению запаха, образованию пены и пузырьков, появлению помутнения, пленки на поверхности среды или осадка на дне сосуда.

Различают два основных способа культивирования микроорганизмов – периодическое и непрерывное. При периодическом культивировании клетки помещают в закрытый сосуд определенного объема, содержащий питательную среду, и задают начальные условия. Постепенно увеличивается плотность популяции, снижается концентрация питательных веществ и накапливаются продукты обмена, т.е. условия существования микроорганизмов изменяются. Периодическую культуру обычно рассматривают как замкнутую систему, переживающую разные фазы развития. Каждая фаза характеризуется определенными физиологическими параметрами. Лаг-фаза – это фаза «привыкания» клеток к среде, при этом происходит увеличение количества ДНК и РНК и индукция синтеза соответствующих ферментов. Лаг-фаза удлиняется, если брать старый посевной материал и переносить клетки в совершенно новую по составу среду. Лаг-фаза сокращается (или может совсем отсутствовать), если активные молодые клетки перенести в свежую среду того же состава и той же температуры. На средах, содержащих смесь субстратов, наблюдается диауксия, при которой после исчерпания одного субстрата культура переходит во вторую лаг-фазу для подготовки к потреблению другого субстрата. В экспоненциальной (логарифмической) фазе клетки растут и делятся с максимальной скоростью, их рост не ограничен. Обычно такие клетки используют в биохимических и физиологических исследованиях. По мере исчерпания субстратов и накопления продуктов обмена скорость роста снижается (фаза замедления роста) и культура переходит в стационарную фазу, в течение которой процессы деления и отмирания клеток в популяции находятся в динамическом равновесии. Для бактерий эта фаза достигается при концентрации в среднем 10 9 клеток/мл, для водорослей и простейших – 10 6 клеток/мл. Когда исчерпание питательных веществ и накопление продуктов метаболизма преодолеют некие пороговые концентрации, начинается фаза отмирания и число клеток в популяции постепенно снижается.

Непрерывное (проточное) культивирование позволяет зафиксировать культуру в какой-то определенной фазе (обычно экспоненциальной). При этом состав среды и условия роста остаются постоянными. Этого добиваются постоянным прибавлением новой питательной среды в сосуд для выращивания и одновременным удалением такого же количества среды с клетками. Простейшая схема организации протока представлена на рис. 45. Подача свежей среды и удаление части суспензии (проток) происходит с той же скоростью, с какой растет культура. В этом случае устанавливается динамическое равновесие.

Некоторые микроорганизмы способны к пребыванию в особом физиологическом состоянии, при котором живые клетки не дают колоний на пригодных для них лабораторных средах, но под микроскопом наблюдаются как живые. Такое некультивируемое состояние (некультивируемая форма) присуще ряду микроорганизмов в природных местообитаниях, например, возбудителям сальмонеллеза и холеры, находящимся вне организма человека. Механизм перехода в некультивируемую форму и обратно не изучен, но есть данные о том, что этот процесс запрограммирован в геноме микроорганизмов и запускается недостатком питательных веществ в природных эконишах. В природных образцах такие микроорганизмы изучают путем прямого наблюдения и с помощью методов молекулярного анализа состава нуклеиновых кислот образца.

↑ Смешанные и чистые культуры микроорганизмов. Накопительные культуры. Способы получения чистых культур

Из-за малых размеров микроорганизмов работа в лаборатории проводится не с одной особью, а с популяцией организмов, или культурой. Культура микроорганизмов, состоящая из клеток одного вида, носит название чистой культуры. Если число видов два или больше, то говорят о смешанной культуре. Для определения систематического положения, физиолого-биохимических свойств и особенностей развития микроорганизмов необходимо получить чистую культуру. Для этого клетки данного вида нужно отделить от клеток других видов и впоследствии исключить возможность попадания посторонних микроорганизмов. При выделении чистой культуры из природных местообитаний, где микроорганизмы в большинстве случаев растут в виде смешанных популяций, на первом этапе обычно пользуются предложенным С.Н. Виноградским методом получения накопительных культур, в которых преобладают организмы определенной группы. Накопление желаемых микроорганизмов происходит за счет создания элективных условий культивирования, благоприятных для данной группы. Для этого нужно учитывать физиолого-биохимические особенности выделяемой культуры. Избирательного подавления роста определенных групп микроорганизмов можно достичь внесением в среду антибиотиков. Преобладать будет та группа микроорганизмов, для которой созданные исследователем условия культивирования наиболее приемлемы. Другие организмы, также присутствующие в пробе, в этих условиях не размножаются, либо характеризуются незначительным ростом. Например, для получения накопительной культуры азотфиксирующих микроорганизмов следует приготовить среду без связанных форм азота. Для замедления развития грамположительных бактерий можно добавить пенициллин, а мицелиальных грибов — нистатин или гризеофульвин. Для накопления спорообразующих микробов часто используют кратковременное прогревание пробы при высокой температуре (10 мин при 80 о С), когда вегетативные клетки погибают, а эндоспоры сохраняют свою жизнеспособность. Необходимо учитывать, что элективные условия – не всегда наилучшие (оптимальные) для роста выделяемой группы, однако сопутствующие микроорганизмы переносят их еще хуже. О получении накопительной культуры судят по характерной микроскопической картине, внешним изменениям среды, появлению определенных продуктов метаболизма. Чистую культуру в дальнейшем можно получить из единичной клетки или из отдельной колонии. Клетку извлекают микропипеткой или микропетлей под микроскопическим контролем и переносят в сосуд со средой. Другим способом является изготовление серии препаратов «висячая капля» из сильно разведенной суспензии. Препараты просматривают под микроскопом и выбирают те, где присутствует одна клетка. Затем их помещают во влажную камеру и микроскопируют вновь через сутки. Капли, в которых произошло размножение клеток, переносят в питательную среду. Чаще используют метод выделения чистой культуры из отдельной колонии, разработанный в лаборатории Р.Коха. Каплю накопительной культуры или ее разведения распределяют по поверхности или в глубине твердой питательной среды, добиваясь разобщения отдельных клеток. Каждая такая клетка впоследствии размножается, образуя колонию из клеток одного вида. Ее снимают петлей и переносят в сосуд с питательной средой. Признаком чистоты культуры является однородность колоний при пересевах и морфологическая однородность клеток при просмотре микроскопических препаратов.

Эта статья еще не написана, но вы можете сделать это .

Источник: http://lomonosov-fund.ru/enc/ru/encyclopedia:0129501

Методы выделения, культивирования и идентификации вирусов

Лабораторные исследованияпри проведении идентификации вирусов и диагностике вирусных инфекций включают следующие этапы: выделение, культивирование, индикация (выявление) и идентификация вирусов.

2.3.1 Культивирование вирусов

Вирусы не растут на искусственных питательных средах, а размножаются только внутриклеточно. Крупным достижением было предложение Р. Гудпасчура в 1932 г. использовать для культивирования вирусов куриные эмбрионы. Окончательное решение проблемы культивирования вирусов оказалось возможным лишь после того, как были разработаны основные способы культивирования клеток вне организма.

Использование куриных эмбрионов. Куриные эмбрионы – практически идеальные модели для культивирования не­которых вирусов (например, гриппа и кори). Замкнутая полость эмбриона препятствует проник­новению микроорганизмов извне, а также развитию спонтанных вирусных инфекций. Эмбрионы применяют для первичного выделения вирусов из патологического материала; для пассирова­ния и сохранения их, а также для получения необходимых количеств вируса. Некоторые возбу­дители (например, герпесвирусы) вызывают характерные изменения (по ним можно распозна­вать заболевание).

Для заражения обычно используют куриные эмбрионы 7–12-дневного возраста. Перед заражением определяют жизнеспособность эмбриона путем овоскопирования (просматривают в проходящем свете). Живые эмбрионы при овоскопировании проявляют двигательную активность, хорошо виден сосудистый рисунок. Простым карандашом очерчивают границы воздушной камеры.

Куриные эмбрионы заражают вируссодержащим материалом в асептических условиях стерильными инструментами, предварительно обработав скорлупу над воздушным пространством йодом и спиртом. Заражение проводят на хорион-аллантоисную оболочку, в амниотическую или аллантоисную полость, либо в желточный мешок (рисунок 29). Выбор метода заражения зависит от биологических свойств вируса.

Рисунок 29 – Схематическое изобра­жение развивающегося куриного эмбриона

Культура клеток. Вначале был использован метод переживающих тканей. Он заключался в том, что в колбу, содержащую питательную среду, вносили кусочек ткани. Клетки некоторых тканей в таких условиях могут пережи­вать (но не размножаться) до 30 дней, а в них могут размножаться вирусы. Однако этот способ давал очень небольшой выход вирусов. Необходимо было разработать условия, при которых клетки ткани могли бы свободно размножаться.

Для получения культур клеток необхо­димо было решить четыре главных задачи:

– получить в необходимом количестве свободные (т. е. изолированные друг от друга) клетки;

– создать такие питательные среды и условия, в которых клетки могли бы активно размножаться;

– обеспечить условия, при которых в культурах клеток не могли бы размножаться бактерии;

– определить методы, с помощью которых можно было бы распознавать рост вируса в культуре клеток и идентифицировать его.

Для выделения изолированных (разобщенных), но жизнеспособных клеток из разрушенных тканей, стали использовать обработку их слабым раствором трипсина, разрушающего межкле­точные мостики. Для культивирования клеток были предложены различные среды, содержащие все необходимые для размножения клеток питательные вещества (аминокислоты, основания, витамины и другие), минеральные соли, имеющие оптимальную рН и т. д. К питательным средам добавляли индикатор, по изменению цвета которого можно было судить о метаболизме клеток и их размноже­нии. Было установлено, что в качестве основы, на которой клетки размножаются и образуют монослой, может быть использовано хорошо обработанное стекло пробирок и колб. Для подавления возможного роста бактерий вируссодержащий материал перед посевом его в культуры клеток стали обраба­тывать антибиотиками.

В 1949 г. Дж. Эндерс, Т. Веллер и Ф. Роббинс показали, что вирус полиомиелита хорошо размножается в первично-трипсинизированных культурах клеток, полученных из почек обезьян. Основной недостаток первично-трипсинизированных клеток заключается в том, что после нескольких пересевов они перестают размножаться. Поэтому предпочтением стали пользоваться культуры таких клеток, которые способны размножаться in vitro бесконечно долго. Такие перевиваемые культуры клеток (клеточные линии характеризуются бессмертием и гетероплоидным кариотипом) получают из опухолевых тканей (HeLa получена из карциномы шейки матки, НЕр-2 – из карциномы гортани; Детройт-6 – из метастаза рака легкого в костный мозг; RН – из опухоли почки человека) или из мутантных клеток с полиплоидным набором хромосом. Однако опухолевые клетки нельзя применять для получения вакцин. Для этих целей используют только культуры таких клеток, которые не содержат никаких контаминантных вирусов и не обладают злокачественностью. Лучше всего этим требованиям отвечают культуры диплоидных клеток.

Полуперевиваемые (диплоидные) культуры клеток – клетки одного генотипа, способные in vitro выдерживать 50–100 пассажей, сохраняя при этом свой исходный диплоидный набор хромосом. Диплоидные линии фибробластов эмбриона человека используются как для диагностики вирусных инфекций, так и при производстве вирусных вакцин. Как оказалось, вирусы могут размножаться не только в культурах клеток, образующих монослой на стекле пробирок, но и в суспензиях живых клеток.

Для обеспечения жизнедеятельности культивируемых клеток необходимы питательные среды. По назначению они делятся на ростовые и поддерживающие. В ростовых питательных средах должно содержаться больше питательных веществ, обеспечивающих активное размножение клеток и формирование монослоя. Поддерживающие среды обеспечивают переживание клеток в уже сформированном монослое в период размножения в них вирусов.

2.3.2 Выделение вирусов

Выделение вирусов в культурах клеток. При выделении вирусов из различных инфекционных материалов (кровь, моча, слизистые отделяемые, смывы из органов) применяют культуры клеток, обладающих наибольшей чувствительностью к предполагаемому вирусу. Для заражения используют культуры в пробирках с хорошо развитым монослоем клеток. Перед заражением клеток питательную среду удаляют и в каждую пробирку вносят по 0,1–0,2 мл взвеси исследуемого материала, предварительно обработанного антибиотиками для уничтожения бактерий и грибов. После 30-60 мин контакта вируса с монослоем клеток удаляют избыток материала, в культуру вносят поддерживающую среду и пробы оставляют в термостате до выявления признаков размножения вируса.

Выделение вирусов на лабораторных животных. При невозможности выделить и идентифицировать вирус стандартными методами in vitro инфекционный материал вводят чувствительным к возбудителю животным, и после развития типичного инфекционного процесса проводят повторное заражение чувствительных клеточных культур. Наиболее часто используют мышей, кроликов и обезьян; для выделения некоторых вирусов (например, вирусов Коксаки) заражают мышат-сосунков. Вследствие дороговизны и сложности содержания лабораторных животных, практически повсеместно их вытеснили кле­точные культуры. Тем не менее животные модели активно используют для изучения особенно­стей патогенеза и формирования иммунных реакций при вирусных инфекциях.

Таким образом, для выделения чистых культур вирусов в лабораторных условиях в настоящее время используются следующие живые объекты (биологические модели): 1) культура клеток (тканей, органов); 2) куриные эмбрионы; 3) лабораторные животные.

2.3.3 Индикация вирусов

Индикация вируса в курином эмбрионе. Индикация вируса в курином эмбрионе производится по гибели эмбриона, положительной реакции гемагглютинации на стекле с аллантоисной или амниотической жидкостью, по образованию фокусных поражений («бляшек») на хорион-аллантоисной оболочке.

Индикация вирусов в культурах клеток. Индикатором наличия вируса в зараженных культурах клеток может служить:

1) развитие специфической дегенерации клеток – цитопатическое действие вируса (ЦПД), имеющее три основных типа: крупно- или мелкоклеточная дегенерация; образование многоядерных гигантских клеток (симпластов ); развитие очагов клеточной пролиферации, состоящих из нескольких слоев клеток (гроздевидная дегенерация клеток ).

Различают два механизма гибели клеток, вызываемой вирусами, – некроз и апоптоз. Некроз происходит из-за необратимых нарушений целостности клеточных мембран, апоптоз – вследствие фрагментации ядерной ДНК под действием клеточной эндонуклеазы.

Цитопатические эффектыоценивают при микроскопии клеточных культур. По степени поражения клеток выделяют вирусы с высокой или умеренной цитопатогенностью:

2) обнаружение внутриклеточных включений. располагающихся в цитоплазме и/или в ядрах пораженных клеток;

3) положительная реакция гемагглютинации (РГА) или гемадсорбции (РГАдс). Некоторые вирусы, в частности, вирус гриппа, обладают особыми рецепто­рами (гемагглютининами), с помощью которых они адсорбируются на эритроцитах и вызывают их склеивание (гемагглютинацию). Такие вирусы легко обнаруживаются с помощью реакции гемагглютинации или гемадсорбции (эритроциты адсорбируются на инфицированных вирусами клетках куль­туры тканей);

4) феномен бляшкообразования. Широкое распространение получил предложенный в 1952 г. Р. Дюльбекко метод бляшек (негативных колоний), позволяющий производить количественное определение вирусов. Для выделения вирусов монослой клеток после удаления питательной среды заражают вируссодержащим материалом и покрывают слоем агара, содержащего индикатор нейтральный красный. Чашки (флаконы) инкубируют при 37 °С. Через 48–96 ч выявляются пятна – бляшки. Они имеют диаметр 1–3 мм и выглядят неокрашенными на розовом фоне. Пятна возникают за счет цитопатического действия вируса;

5) цветная реакция Солка. О росте вирусов в клетках можно судить с помощью индикатора, добавляемого к питательной среде. Если клетки активно осуществляют метаболизм, рН среды сдвигается в кислую сторону, и среда окрашивается в желтый цвет. В случае размножения вируса клетки погибают, рН среды мало меняется, и она сохраняет первоначальный (малиновый) цвет или (при нейтральной рН) приобретает оранжевый;

6) реакция интерференции (используется при отсутствии ЦПД, гемагглютинации и гемадсорбции): исследуемая культура повторно заражается вирусом, вызывающим ЦПД. В положительном случае ЦПД будет отсутствовать (реакция интерференции положительна). Если в исследуемом материале вируса не было, наблюдается ЦПД.

Кроме того, для обнаружения вируса в культурах клеток могут быть использованы различные серологические реакции.

Индикация вирусов на лабораторных животных. Индикация вируса основана на обнаружении у животных признаков инфекционного заболевания, регистрации их гибели, изучении характера патоморфологических и патогистологических изменений в тканях и органах, выявлении положительной реакции гемагглютинации.

2.3.4 Методы идентификации вирусов

Определение типа вируса (его идентификация) основано на нейтрализации биологической активно­сти вируса с помощью типоспецифических сывороток. Конечный результат ее может быть установлен на основании следующих признаков:

1) нейтрализация цитопатического действия. в культуральную среду, содержащую изучаемый вирус, вносят коммерческую сыворотку (например, к вирусу краснухи при подозрении на неё), инкубируют и заражают вторую культуру; через 1–2 дня в неё вносят известный цитопатогенный вирус. При наличии цитопатогенного эффекта делают вывод о том, что первая культура была заражена вирусом, соответствовавшим антителам примененной сыворотки;

2) нейтрализация реакции гемадсорбции ;

3) изменение проявления цветной пробы ;

4) задержка (торможение) реакции гемагглютинации. смешивают культуральную среду, со­держащую возбудитель, с известной коммерческой антисывороткой и вносят в культуру клеток. После инкубации определяют способность культуры к гемагглютинации и при её отсутствии делают заключение о несоответствии вируса антисыворотке.

5) нейтрализация в опытах на животных .

Таким образом РН (реакция нейтрализации) основана на подавлении соответствующей реакции, феномена, развития инфекционного процесса после внесения в культуру или введения в организм животного смеси вируса со специ­фичными AT, содержащимися в диагностической сыворотке.

Вопросы для самоконтроля

1 Назовите основные принципы классификации вирусов.

2 Приведите русские и латинские названия основных семейств вирусов человека и животных.

3 Назовите типовых представителей основных семейств вирусов и заболевания, вызываемые ими.

4 Каковы особенности морфологии и ультраструктуры вирусов человека и животных (основных семейств)?

5 Назовите РНК-геномные и ДНК-геномные фитовирусы.

6 Какие этапы включают в себя лабораторные исследования при идентификации вирусов и диагностике вирусных инфекций?

7 Какие биологические модели используются для выделения и культивирования вирусов человека и животных?

8 Как происходит заражение куриных эмбрионов в лабораторных условиях?

9 Какие методы получения культуры клеток вы знаете?

10 Как проводят идентификацию вирусов в курином эмбрионе и на лабораторных животных?

11 Какие существуют методы индикации вирусов на культуре клеток?

12 В чем заключается назначение и сущность реакций нейтрализации вирусов?

13 Назовите способы постановки реакций нейтрализации вирусов.

Источник: http://helpiks.org/2-20205.html

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ. Основные источники получения микроорганизмов, используемых для культивирования. 1.Классический путь – проводится выделение. — презентация

Похожие презентации

Презентация на тему: » КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ. Основные источники получения микроорганизмов, используемых для культивирования. 1.Классический путь – проводится выделение.» — Транскрипт:

1 КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ

2 Основные источники получения микроорганизмов, используемых для культивирования. 1. Классический путь – проводится выделение микроорганизмов из мест, где обитание того или иного вида наиболее вероятно. В элективных средах путем варьирования различных факторов создаются избирательные условия для преимущественного развития определенного микроорганизма. Таким образом получают накопительные культуры микроорганизмов. Следующий этап – выделение чистых культур. Для этого используют плотные питательные среды, на которые засевают образцы проб из накопительных культур. Отдельные клетки микроорганизмов на плотных питательных средах образуют изолированные колонии, при их последующем пересеве получаются чистые культуры продуцента. 2. Другой путь подбора микроорганизмов – из имеющихся коллекций микроорганизмов.

3 Получение накопительных культур Выделение чистой культуры данного микроорганизма будет успешным, если он присутствует в смешанной популяции в достаточно высокой концентрации, т. е. количественно преобладает. Разработанные методы накопления имеют целью добиться увеличения относительного количества данного организма благодаря созданию лучших условий для его роста и выживания по сравнению с другими или путем пространственного отделения его от других членов популяции. К физическим методам накопления следует относить регуляцию роста температурой, тепловую и ультразвуковую обработку, ультрафиолетовое облучение, приводящие к гибели или подавлению роста других организмов, присутствующих в популяции, но существенно не затрагивающие выделяемые клетки.

4 Можно также использовать преимущества в некоторых физических свойствах изучаемого микроорганизма, таких, как его размеры и подвижность; это позволяет в значительной мере отделить данный организм от других в популяции. В основе действия химических методов лежит использование токсичных веществ, которые подавляют рост оставшейся части популяции, не оказывая влияния на выделяемый микроорганизм. Кроме того, это могут быть вещества, служащие источниками питания, используемыми преимущественно отдельными микроорганизмами в смешанной популяции. Биологические методы включают использование специфических хозяев для выделяемого организма, а также преимуществ некоторых патогенных свойств микроорганизма (например, его инвазивность), которыми не обладают другие представители популяции. Во многих случаях для получения максимального эффекта накопления сочетают физические, химические и биологические методы. Как правило, накопительные культуры получают в закрытых системах, т. е. микроорганизмы выращивают в обычных периодических (стационарных) условиях на чашках Петри, в колбах или пробирках, где в среде культивирования концентрация питательных веществ и продуктов метаболизма постоянно изменяется в процессе роста клеток.

5 Получение чистых культур Из накопительных культур микроорганизмы обычно выделяют путем их пространственного отделения от других форм на твердой среде, где они растут в виде колоний. Для микроорганизмов, не растущих на твердых средах, можно использовать метод предельного разведения, последовательно перенося клетки в отдельные пробирки с жидкой средой. Для выделения микроорганизмов в виде чистых культур известно сравнительно мало методов. Чаще всего используют способ изолирования отдельных клеток на твердой питательной среде или метод предельных разведений. Однако получение отдельной колонии не всегда гарантирует чистоту культуры, поскольку колонии могут вырасти не только из отдельных клеток, но из их скоплений. Для выделения предпочтительнее использовать неселективную среду, поскольку на ней лучше растут контаминирующие микроорганизмы и их легче обнаружить. Не следует очень быстро отбирать колонии, поскольку за данный отрезок времени могут не вырасти медленно растущие контаминирующие организмы.

6 Чистые культуры Из чистой культуры обычно вырастают одинаковые колонии, и при микроскопировании выявляются схожие клетки, в частности, по морфологии и результатам окраски по методу К. Грама. Однако возможны исключения, например, колонии, вырастающие из чистой культуры, могут быть гладкие (S) и шероховатые (Р). Кроме того, в чистых культурах различных микроорганизмов могут появиться морфологически различные клетки (полиморфизм), цисты и споры. Наконец, некоторые микроорганизмы проявляют грам вариабельность. Тем не менее, указанные критерии широко используются при определении чистоты культур.

7 Определение чистоты культуры При определении чистоты культуры учитывают морфологию колоний, формирующихся на плотных питательных средах, оценивая следующие признаки: профиль – плоский, выпуклый, кратерообразный, конусовидный и т.д.; форму – округлая, амебовидная, неправильная, ризоидная и т.д.; размер (диаметр) – измеряют в миллиметрах; если размеры колонии не превышают 1 мм, то их называют точечными; поверхность – гладкая, шероховатая, бороздчатая, складчатая, морщинистая, с концентрическими кругами или радиально исчерченная; блеск и прозрачность – колония блестящая, матовая, тусклая, мучнистая, прозрачная; цвет – бесцветная (грязно-белые колонии относят к бесцветным) или пигментированная; особо отмечают выделение в субстрат пигмента;

8 край – ровный, волнистый, зубчатый, лопастной, ризоидный, бахромчатый и т.д.; структуру – однородная, мелко- или крупнозернистая, струйчатая и т.д.; консистенцию: колония может легко сниматься с агара, быть плотной, мягкой или врастающей в агар, маслянистой, слизистой (прилипает к петле), вязкой, пленчатой (снимается целиком), быть хрупкой (легко ломается при прикосновении петлей). Размеры и многие другие особенности колонии могут изменяться с возрастом и зависят от состава среды. Поэтому при их описании указывают возраст культуры, состав среды и температуру культивирования.

9 Рис. Форма колонии 1 – круглая; 2 – круглая с фестончатым краем; 3 – круглая с валиком по краю; 4, 5 – ризоидные; 6 – с ризоидным краем; 7 – амебовидная; 8 – нитевидная; 9 – складчатая; 10 – неправильная; 11 – концентрическая; 12– сложная

11 Рис. Профиль колонии 1 – изогнутый; 2 – кратерообразный; 3 – бугристый; 4 – врастающий в субстрат; 5 – плоский; 6 – выпуклый; 7 – каплевидный; 8 – конусовидный

12 Рис. Край колонии 1 – гладкий; 2 – волнистый; 3 – зубчатый; 4 – лопастной; 5 – неправильный; 6 – реснитчатый; 7 – нитчатый; 8 – ворсинчатый; 9 – ветвистый

13 Рис. Структура колонии 1 – однородная; 2 – мелкозернистая; 3 – крупнозернистая; 4 – струйчатая; 5 – волокнистая

Источник: http://www.myshared.ru/slide/981510

Смотрите так же:

  • Гнойная опухоль на яичнике Гнойные тубоовариальные опухоли Гнойные тубоовариальные опухоли возникают как осложнения течения сальпингоофорита (см. Сальпингоофорит ). При воспалении эндотелия трубы в ее просвете накапливается экссудат, который по мере прогрессирования процесса может приобретать гнойный характер. […]
  • Влияние антибиотика при зачатии Влияние антибиотиков на зачатие Процесс зачатия – это очень ответственный момент в жизни родителей. Но еще более важно правильно спланировать этот момент. Самая лучшая беременность с точки зрения специалиста – это запланированная беременность. Планирование помогает избавиться от многих […]
  • Боюсь родов второго ребенка Боюсь рожать второй раз — что делать? Содержание статьи В детстве играя в куклы, все девочки представляют себя мамами, но дело в том, что когда повзрослевшая девушка выходит замуж и получает возможность стать мамой, она на самом деле не знает, что ее ждет. Беременная женщина […]
  • Антитела к хгч слабоположительные Антитела к ХГЧ – показатель угрозы прерывания беременности. Основные показания к применению: обследование женщин при подготовке к беременности с целью профилактики и лечения невынашивания беременности и предупреждения преждевременных родов, выяснение причин прерывания беременности, […]
  • Выделения при кало Показанием к обеспечению указанными средствами является наличие противоестественных отверстий и стом. Однокомпонентные системы - это мешки с "припаянной" клеевой основой. Двухкомпонентные системы состоят из отдельной адгезивной пластины и мешка, герметично соединяющегося с […]
  • Ат к хгч igm ХГЧ, вырабатывающийся на ранних сроках беременности в тканях эмбриона, препятствует прерыванию беременности, которая может возникать при отслаивании эндометрия после имплантации яйцеклетки. После проведения плазмафереза происходит снижение титра IgM и IgG до нормы/слабоположительных […]
  • Выделения желтыми комочками Белые комочки в горле Многие из нас не слишком серьезно относятся к своим многочисленным ангинам и простудам, считая, что эти заболевания пройдут и без особого лечения. Чаще всего так и происходит, но иногда наш иммунитет сильно падает, заболевания переходят в хроническую форму и […]
  • Выделение пенопласта Где возможно применять пенопласт: характеристики его вредности Применение пенопласта в качестве слоя теплоизоляции Вредность пенопласта от выделения отравляющих веществ Сфера использования пенопластовой теплоизоляции Современное строительство задействует большое разнообразие […]
  • Влияние марихуаны на зачатие Влияние травки на зачатие ребенка Влияет ли курение конопли или по-другому – марихуаны на зачатие ребенка? Снижаются ли шансы забеременеть? Вердикт по этим вопросам еще не вынесен. Некоторые ученые говорят, что активный ингредиент марихуаны (THC) снижает уровень тестостерона, что может […]
  • Валемидин от климакса Валемидин снижает давление или нет? Применяется ли лекарственный препарат «Валемидин» от давления? Этот комбинированный медикамент включает в себя только растительные компоненты, которые обеспечивают «Валемидину» широкий спектр действия. Лекарство мягко воздействует на нервную систему […]

Related posts